by Diana Duarte 1,2ORCID,Armando Cardoso 3,4 andNuno Vale 1,5,*

1OncoPharma Research Group, Center for Health Technology and Services Research (CINTESIS), Rua Doutor Plácido da Costa, 4200-450 Porto, Portugal
2波尔图大学药学院，Rua Jorge Viterbo Ferreira, 228, 4050-313 Porto, Portugal
3NeuroGen 研究小组，健康技术和服务研究中心 (CINTESIS)，Rua Doutor Plácido da Costa，4200-450 Porto，葡萄牙
4解剖学单元，生物医学系，医学系，波尔图大学，阿拉米达教授 Hernâni Monteiro, 4200-319 Porto, Portugal
5阿拉米达波尔图大学医学院社区医学、健康信息和决策 (MEDCIDS) 系 Hernâni Monteiro 教授，葡萄牙波尔图 4200-319
*通讯作者。

学术编辑：Maria E. Mycielska
诠释。J.摩尔。科学。 2021 , 22 (14), 7408; https://doi.org/10.3390/ijms22147408
收稿日期：2021 年 7 月 2 日 / 修订日期：2021 年 7 月 6 日 / 接受：2021 年 7 月 8 日 / 发布时间：2021 年 7 月 10 日
（这篇文章属于特刊癌细胞代谢）

摘要

几种中枢神经系统 (CNS) 药物表现出有效的抗癌活性。本研究旨在设计一种新的组合模型，将不同的中枢神经系统药物和抗肿瘤药物（5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和紫杉醇 (PTX)）分别用于结直肠癌和乳腺癌的治疗。分别对 HT-29 结肠癌细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞单独评估 5-FU 和 PTX 以及与不同 CNS 药物联合使用的细胞毒性作用。还对 HT-29 细胞中的三种抗疟药单独和与 5-FU 联合使用进行了评估。以固定比例将不同的方案和浓度添加到培养的细胞中并孵育48小时。使用 MTT 和 SRB 测定法评估细胞活力。使用 Chou-Talalay、Bliss Independence 和 HSA 方法评估协同作用。我们的结果表明，氟奋乃静，与联合使用相比，氟西汀和苯托品单独使用时具有增强的抗癌活性，使其成为结直肠癌 (CRC) 药物再利用的理想候选者。对于 MCF-7 细胞，舍曲林是最有希望单独用于药物再利用的候选者，IC 最低50值。对于 HT-29 细胞，中枢神经系统药物舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 同时组合显示出所有组合中最强的协同作用。在 MCF-7 乳腺癌细胞中，氟西汀、氟奋乃静和苯托品与 PTX 的组合对 IC 50以下的所有浓度产生协同作用. 我们还发现，在 5-FU 之前施用抗疟药青蒿琥酯在降低 HT-29 细胞活力方面比逆向药物方案或同时组合产生更好的结果。这些结果表明，两种选定细胞系的 CNS 药物活性不同，无论是单独的还是联合使用的，并支持一些 CNS 药物可能是这些类型癌症中药物再利用的有希望的候选者。此外，这些结果表明应进一步评估 5-FU 或 PTX 与 CNS 药物的组合。这些结果还表明，除乳腺癌外，抗疟药也可用作结直肠癌的抗肿瘤剂。

一、简介
癌症是世界范围内的一个主要健康问题，是美国 (USA) 的第二大死亡原因。2021 年，美国估计有 1,898,160 例新癌症病例和 608,570 例癌症死亡。结直肠癌 (CRC) 是美国癌症死亡的第二大原因，到 2021 年，估计有 149,500 例新诊断病例和 52,980 例死于此类癌症。其中，17,930 例新病例和 3640 例死亡发生在 50 岁以下的人群中。乳腺癌是女性癌症死亡的第二大原因，2021 年美国估计有 281,550 例新病例和 43,600 例死亡[ 1]。尽管手术和化疗在CRC的治疗中起主要作用，但有效率仍然很低。因此，开发用于癌症治疗的新药迫在眉睫，但这一过程耗时、成本高、批准率低[ 2 ]。此外，大多数新的化疗药物都存在毒性问题，导致副作用 [ 3 ]。因此，开发和探索新的药物策略以克服与开发用于癌症治疗的新药相关的障碍非常重要。
药物再利用（或重新定位）和药物组合是近年来引起许多研究小组关注的两种策略。药物再利用是一种将已经获得食品和药物管理局 (FDA) 批准的药物用于除原有治疗适应症之外的新治疗适应症的策略。该策略在新药开发方面具有优势，因为重新利用的药物已获得 FDA 批准，并且具有已知的安全性和毒性特征。这可以节省时间和金钱，增加这些药物进入临床试验的可能性 [ 4 ]。
药物组合是一种策略，包括施用两种或多种药物的混合物 [ 5 ]。这种方法可以克服肿瘤内和肿瘤间的异质性。肿瘤内异质性是由同一肿瘤的不同细胞之间的不同药物反应导致的，这有助于疾病的进展和耐药性的出现。肿瘤间异质性对应于同一类型癌症患者之间的异质性，使得难以预测不同患者对相同治疗的反应[ 6 ]。联合疗法有助于克服这些问题，多项研究表明它们确实比单一疗法更有效 [ 7 , 8, 9 , 10 , 11 , 12 ]。药物组合的功效取决于给药的时间表（例如，同时或顺序）和组合模型的设计 [ 13 , 14 ]，以充分利用药物之间的相互作用。在药理学上，两种或多种药物的组合将更有效，药物之间的协同作用越大，即与单独使用两种药物相比，其有效性的增强作用越大[ 15 ]。
已经探索了中枢神经系统 (CNS) 药物的再利用，一些研究证明了这类药物在降低肿瘤细胞活力方面的有效性 [ 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ]。中枢神经系统药物可分为三大类：抗精神病药、抗抑郁药和抗惊厥药。抗精神病药和抗抑郁药可根据其作用机制细分为三环类抗抑郁药（TCA）、单胺氧化酶抑制剂（MAOI）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI）、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂（NDRI） ) 和非典型抗抑郁药 [ 20]。几种 CNS 药物已显示出药物再利用的潜力，例如丙咪嗪、吩噻嗪、三氟拉嗪、匹莫齐特和丙戊酸。例如，丙咪嗪已在不同类型的癌症中进行了研究，如神经胶质瘤 [ 19 ]、乳腺癌 [ 21 ]、头颈癌 [ 22 ]、急性/慢性髓性白血病 [ 23、24 ] 等。吩噻嗪类药物是一种常规抗精神病药物家族，其成员主要用作多巴胺 D2 拮抗剂，也已在乳腺癌 [ 25 ]、小细胞肺癌 [ 18 ] 和口腔癌 [ 26 ] 中进行了研究]。三氟拉嗪是一种 FDA 批准的吩噻嗪和 D2 受体拮抗剂，已经在胶质母细胞瘤 [ 27 ] 和肺癌 [ 28 ] 等中进行了研究。匹莫齐特是另一种用于图雷特氏症的 D2 阻断剂，可对抗癌细胞，包括癌细胞的凋亡作用和Bcl-2表达降低[ 29 ]。Valproate (Valproic acid) 是一种抗癫痫药物，可阻断 Na +通道、GABA 转氨酶和 Ca 2+通道。这种药物用于癫痫、偏头痛和急性躁狂发作。几项研究表明它在对抗淋巴瘤 [ 30 ]、前列腺 [ 31 ] 和乳腺癌 [32 ] 和膀胱 [ 33 ] 和肝细胞癌 [ 34 ] 等。
在这项工作中，我们假设不同的 CNS 药物（方案 1 A 和表 1）可以在 CRC 和乳腺癌治疗中分别与 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和紫杉醇 (PTX) 协同作用。5-FU 是一种常用于 CRC 治疗的抗肿瘤药物，但其使用存在一些局限性，包括其半衰期短、细胞毒性高和生物利用度低 [ 35 ]。PTX 是一种化学治疗剂，是一种有丝分裂抑制剂，用于治疗晚期卵巢癌和其他各种癌症，包括乳腺癌和肺癌。PTX 的使用受到耐药性及其副作用的限制 [ 36]。这种组合模型由抗肿瘤药物和不同的再利用药物的组合组成，旨在通过使用毒理学可接受的药物来提高参考药物的活性并同时降低其治疗剂量。

图式1. 联合用药的化学结构。( A ) 中枢神经系统药物：( 1 ) 司来吉兰，( 2 ) 沙芬酰胺，( 3 ) 恩他卡朋，( 4 ) 托卡朋，( 5 ) 拉曲哌啶，( 6 ) 氟奋乃静，( 7 ) 硫利达嗪，( 8 ) 氟西汀，( 9 ) 苯托品，（10）卡比多巴，（11）溴隐亭，（12）奈匹司他，（13）东莨菪碱，（14）卡马西平，（15）舍曲林和（16）卡巴拉汀。（乙）抗疟药：（18）甲氟喹，（19）氯喹和（20）青蒿琥酯。

表 1. 本研究中使用的中枢神经系统药物及其作用机制。

最近，我们小组还开发了一种新的联合模型，在MCF-7乳腺癌细胞中使用不同的抗疟药和抗肿瘤药物[ 37 ]。几种抗疟药已与多柔比星和紫杉醇联合使用，这两种抗肿瘤药物常用于乳腺癌治疗。结果非常有希望，发现最佳组合对应于抗疟药甲氟喹、氯喹和青蒿琥酯[ 37 ]。尽管（家族性）乳腺癌与结直肠癌之间的关系是一个有争议的话题，但最近发现，最初与 CRC 相关的NTHL1基因的罕见突变也会导致乳腺癌 [ 38]。出于这个原因，我们决定在本研究中也包括这些抗疟药（方案 1 B），以确认此类药物在 HT-29 结肠癌细胞中的抗肿瘤活性。我们已经证明，5-FU 和一些抗疟药的组合也会在 HT-29 细胞中诱导抗肿瘤作用。有趣的是，对于青蒿琥酯，我们发现药物方案会影响这种组合的抗癌作用，当青蒿琥酯在 5-FU 之前给予 HT-29 细胞时效果会更大。
我们证明了一些 CNS 药物，如氟奋乃静、氟西汀和苯托品，单独使用比与 5-FU 联用更能降低 HT-29 结肠癌细胞的活力。在 MCF-7 细胞中，舍曲林在单独使用时是最有希望的再利用药物，IC 50值最低。与 HT-29 电池相比，IC 50测试的 CNS 药物在乳腺癌细胞中的含量较高，表明这些药物在 CRC 中的疗效更好。我们还发现，与这些细胞中的每种药物单独相比，5-FU 与舍曲林和硫利达嗪的组合诱导了更大的抗肿瘤作用。结合起来，MCF-7 的结果比 HT-29 细胞更有希望，PTX 与氟西汀、苯托品和氟奋乃静的组合产生了更多的协同对。

2. 结果
   2.1 HT-29 结直肠癌细胞
   2.1.1 5-FU 作为单药对细胞活力的影响
   我们分析了抗肿瘤药物 5-FU 在 HT-29 结直肠癌细胞系中的抗肿瘤潜力，以确认其在此类癌症中的功效。用浓度范围为 0.1-100 μM 的 5-FU 处理细胞 48 小时，并通过 MTT（一种测量线粒体活性的活力测定法）评估细胞存活率。5-FU 的 MTT 测定结果在图 1A中给出。基于这些结果，获得了剂量反应曲线并计算了 5-FU 的 IC 50值（图 1乙）。该值被进一步用于组合中。我们的结果表明，5-FU 在浓度高于 10 µM 时具有显着活性，而较高浓度的细胞活力几乎没有差异。细胞对 5-FU 的细胞毒性作用表现出轻微的反应，小于 4 µM 可杀死几乎 50% 的细胞。这些结果支持 5-FU 在治疗 CRC 中的抗癌活性，并证明其在本研究中提出的组合中的使用是合理的。

图 1. 5-FU 对 HT-29 细胞的影响。（一）细胞活力和（乙）剂量反应。在增加浓度的 5-FU 存在下培养细胞，48 小时后，进行 MTT 测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次 ( n = 3) *** 与对照组相比具有统计学显着性，p < 0.001。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

2.1.2. 中枢神经系统药物和抗疟药物作为单一药物对细胞活力的影响
我们接下来评估了不同中枢神经系统药物作为单一药物的可能抗肿瘤作用，即司来吉兰、恩他卡朋、托卡朋、拉曲哌啶、氟奋乃静、沙芬酰胺、卡比多巴、东莨菪碱、苯托品、硫利达嗪、氟西汀、奈匹司他和溴隐亭在 HT-29 结肠癌细胞中的抗肿瘤作用。在这项研究中，我们还根据我们之前的结果 [ 37 ] 纳入了三种抗疟疾药物（甲氟喹、氯喹和青蒿琥酯），以确认这些药物是否会在除 MCF-7 乳腺癌之外的另一种细胞系中保持其抗癌活性细胞。HT-29 细胞用增加浓度的每种药物处理，从 1 µM 到 100 µM，以评估处理 48 小时后的细胞活力。
根据 MTT 结果，我们发现拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯在 HT-29 细胞中显示出显着的抗肿瘤活性。即使在 1 µM 的浓度下，latrepirdine（图 2 A）的细胞毒性作用也很显着，其中 7.75 µM 导致超过 50% 的细胞减少（图 2 B）。在所有单独测试的药物中，氟奋乃静的抗肿瘤作用最强，10 µM 以上的浓度几乎杀死了所有细胞（图 2 C）。事实上，氟奋乃静的 IC 50最低，小于 2 µM（图 2D)。氟西汀治疗的 MTT 测定表明，该 CNS 药物在 HT-29 细胞中对所有超过 10 µM 的浓度测试都具有强烈的细胞毒性作用（图 2 E）。氟西汀的剂量反应曲线显示 IC 50值为 6.12 µM（图 2 F）。Benztropine 在高于 10 µM 的浓度下显示出显着的抗肿瘤作用（图 2 G），获得的 IC 50值为 18.23 µM。硫利达嗪处理还显着降低了 HT-29 细胞活力，从 1 µM 降低到 100 µM，对高于 5 µM 的所有浓度（图 3 A）具有强烈影响，IC 50值为 4.26 µM（图 3乙）。以高于 1 µM 的剂量使用舍曲林处理 48 小时对细胞活力有很强的影响（图 3 C），导致 IC 50值小于 3 µM（图 3 D）。所有浓度超过 10 µM 的抗疟药甲氟喹都对 HT-29 细胞的细胞活力有很强的影响，超过 50% 的细胞无法存活（图 3 E）。剂量反应曲线导致 IC 50值为 11.49 µM （图 3 F）。青蒿琥酯是另一种抗疟疾药物，在所有浓度高于 10 µM（图 3 G）和低于 20 µM的 IC 50值（图3）下也显示出对这些细胞的良好功效H）。其他 CNS 药物和氯喹的 MTT 测定表明这些药物在降低 HT-29 细胞活力或 IC 50超过 20 µM方面缺乏功效，因此从药物组合中丢弃。这些结果表明中枢神经系统药物和抗疟疾药物都是与 5-FU 联合使用的良好候选者。表 2总结了在这项工作中单独测试的所有药物的 IC 50。

图 2. 一些中枢神经系统药物对 HT-29 细胞的影响。( A ) latrepirdine 对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。( C )氟奋乃静对细胞活力的影响和( D )剂量反应曲线。（E）氟西汀对细胞活力的影响和（F）剂量反应曲线。( G ) 苯托品对细胞活力的影响和 ( H) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

图 3. 一些中枢神经系统药物和抗疟药物对 HT-29 细胞的影响。( A ) 硫利达嗪对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。（C）舍曲林对细胞活力的影响和（D）剂量反应曲线。( E ) 甲氟喹对细胞活力的影响和 ( F ) 剂量反应曲线。( G ) 青蒿琥酯对细胞活力的影响和 ( H) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

表 2. 5-FU、几种 CNS 药物和一些抗疟药对 HT-29 结肠癌细胞的细胞毒性。IC 50值作为平均值给出。
2.1.3。5-FU与不同中枢神经系统药物和抗疟药物的各种组合的作用
在找到 CRC 治疗中药物再利用的最佳候选者及其 IC 50值后，我们使用我们之前工作中开发的组合模型评估了 5-FU 与每种药物的组合 [ 37 ]。具体而言，HT-29细胞分别用两种药物单独或以固定比例组合处理，浓度分别为0.25×IC 50、0.5×IC 50、IC 50、2×IC 50和4×IC 50，两个细胞进行了基于测试：MTT 和 SRB。还对用每种药物单独和组合处理的细胞进行了形态学评估。根据IC 50选择最有希望的药物组合药物价值。为此，评估了 5-FU 和表 2中 IC 50值低于 20 µM 的每种药物的组合：拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯。
当与 5-FU 结合时，在任何浓度下，通过 MTT 和 SRB 测定，latrepirdine 都没有任何显着的抗癌作用（分别为图 4 A、B）。在高于 IC 50的浓度下，与硫利达嗪的组合导致细胞活力和细胞蛋白质合成的降低与单独的硫利达嗪相似。在 4 × IC 50的浓度下，5-FU 加硫利达嗪的组合表现出比硫利达嗪增强但不显着的抗癌作用（图 4 C、D）。与较高浓度的 5-FU 单独相比，与 5-FU 和舍曲林的组合在两种测定中也显示出显着的抗癌作用（图 4E,F)。在 4 × IC 50的浓度下，可以看到舍曲林和舍曲林+5-FU 之间的微小差异，但这并不显着。与甲氟喹的组合导致所有浓度都显示出比单独使用 5-FU 更大的抗癌作用（图 4 G，H）。在这些组合上看到的活性可能是单独使用甲氟喹的强抗癌活性的结果。形态学上，结果与 MTT 和 SRB 测定一致。在 4 × IC 50的浓度下，与对照细胞和 5-FU 相比，所有组合都导致细胞数量减少，细胞更小更圆，这表明细胞死亡（图 5）。在 5-FU 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的组合中，我们发现在 2 × IC 50浓度下，组合药物的结果比单独的再利用药物差，证明了药物之间存在一种竞争机制。两种药物一起给药时，主要在 MTT 测定中。此外，对于较高浓度 (4 × IC 50 )，组合药物获得的结果并没有显示单独使用再利用药物的改进（图 6）。显微镜下，浓度为 4 × IC 50，仅在 5-FU、对照细胞和处理细胞之间发现细胞之间的差异；单一药物和药物组合之间的差异非常细微，两种治疗均导致细胞数量减少、聚集体形成减少和细胞变圆（图 7）。

图 4. 联合治疗 48 小时后 HT-29 的生长抑制，MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于浓度为IC 50 0.25、0.5、1、2和4倍的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) 5-FU 加拉曲吡定对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) 5-FU 加硫利达嗪对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) 5-FU 加舍曲林对细胞活力和 ( F ) 细胞蛋白质合成的影响。(克) 5-FU 加甲氟喹对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

图 5.与载体 ( A )、5-FU ( B )、latrepirdine ( C )、latrepirdine + 5-FU ( D )、硫利达嗪 ( E )、硫利达嗪 + 孵育 48 小时后 HT-29 细胞的显微细胞可视化5-FU ( F )、舍曲林 ( G )、舍曲林 + 5-FU ( H )、甲氟喹 ( I ) 和甲氟喹 + 5-FU ( J )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。

图 6. 联合治疗 48 小时后 HT-29 的生长抑制，MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于其IC 50的0.25、0.5、1、2和4倍浓度的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) 5-FU 加氟奋乃静对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) 5-FU 加氟西汀对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) 5-FU 加苯托品对细胞活力和 ( F ) 细胞蛋白质合成的影响。(克) 5-FU 加青蒿琥酯对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

图 7.与载体 ( A )、5-FU ( B )、氟奋乃静 ( C )、氟奋乃静 + 5-FU ( D )、氟西汀 ( E )、氟西汀 + 孵育 48 小时后 HT-29 细胞的显微细胞可视化5-FU ( F )、苯托品 ( G )、苯托品 + 5-FU ( H )、青蒿琥酯 ( I ) 和青蒿琥酯 + 5-FU ( J )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。

2.1.4。5-FU 和 CNS 药物/抗疟药的协同组合
为了研究 5-FU 与先前药物组合的效果，并在基于 MTT 和 SRB 测定找到最有希望的药物后，使用 CompuSyn 软件使用 Chou-Talalay 方法计算组合指数 (CI)。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。分数效应是一个介于 0 和 1 之间的值，其中 0 表示药物不影响细胞活力，1 表示药物对降低细胞活力产生完全影响。5-FU 加拉曲吡定的组合显示出很少的协同作用，只有一对协同作用（图 8A），Fa 值为 0.44（表 3）。5-FU 加氟西汀和苯托品的两种组合仅对一对显示出协同作用（分别为图 8 B、C），Fa 值分别为 0.73 和 0.87（表 3）。与硫利达嗪的组合是最有希望的组合之一，具有三对协同作用（图 8 D），Fa 值达到 0.75（表 3）。对于舍曲林，所有组合均具有协同作用（图 8 E）并产生 0.85 的 Fa 值（表 3）。5-FU 和甲氟喹的组合也产生了一对协同作用（图 8 F），Fa 值为 0.848（表 3）。青蒿琥酯和氟奋乃静与 5-FU 的组合没有产生任何协同作用（分别为图 8 G、H），所有浓度对的 CI > 1（表 3）。总之，这些结果表明，一些中枢神经系统药物，如舍曲林和硫利达嗪，可能有望评估未来的组合。

图 8. Chou-Talalay 法 Fa-CI 图 5-FU 加拉曲吡定 ( A )、氟西汀 ( B )、苯托品 ( C )、硫利达嗪 ( D )、舍曲林 ( E )、甲氟喹 ( F )、青蒿琥酯 ( G )和氟奋乃静（H）。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。CI < 1、CI = 1 和 CI > 1 分别是指协同作用、相加作用和拮抗作用。

表 3. 5-FU 加 CNS 药物和抗疟药不同组合的 CI 值和各自的分数效应。红色的 CI 表示具有协同作用的药物对的浓度。用每种药物的IC 50 (总剂量) 的0.25、0.5、1、2和4倍处理细胞。

除了 Chou-Talalay 方法外，还使用 SynergyFinder 2.0 软件通过 Bliss Independence 和 Highest Single Agent (HSA) 方法评估药物相互作用。该软件是一个网络应用程序，用于通过不同的协同作用评估方法对多药组合分析数据进行交互式分析和可视化。Bliss 独立模型假设两种药物独立产生作用的随机过程，可以根据独立事件的概率计算预期的联合作用 [ 57]。HSA 模型是协同作用评估最简单的参考模型之一，并指出预期的联合效应是相应浓度下单一药物反应的最大值。在该软件中，药物组合的协同作用得分是所有剂量组合测量值的平均值，给出正值或负值，分别对应于协同作用或拮抗作用。2D 和 3D 协同图分别以红色和绿色突出显示协同和拮抗剂量区域 [ 57 ]。
通过 Bliss 和 HSA 模型（分别为图 9 A、B）， Latrepirdine 与 5-FU 组合显示负协同作用评分，与 Chou-Talalay 结果一致，表明所有对均具有拮抗作用。硫利达嗪通过 Bliss 模型表现出协同作用，协同作用得分为 5.178（图9C ）。HSA 模型的结果显示出拮抗作用，但在某些区域有协同作用，如图 9 D 中的红色所示。与先前的结果一致，5-FU 与舍曲林的组合在 Bliss 中均产生了强烈的协同作用（图9 E) 和 HSA 模型 (图 9F)，协同效应得分分别为 22.203 和 3.042。对于甲氟喹，使用 Bliss 和 HSA 模型未观察到协同作用（分别为图 9 G、H）。通过 Bliss 模型，氟奋乃静与 5-FU 组合导致负协同评分，表明拮抗作用（图 10A）。通过 HSA 模型，一般协同评分也是负的，但 2D/3D 图中的一个区域显示了一对具有协同行为的浓度（图10B ）。氟西汀和苯托品在 Bliss 和 HSA 模型中未显示任何协同作用，表明这些药物与 5-FU 之间存在拮抗行为（图 10C-F)。与之前通过 Chou-Talalay 方法获得的结果相反，通过 Bliss 方法评估的 5-FU 加青蒿琥酯的组合产生了 0.411 的正协同得分，在 2D/3D 图上的红色区域处于最低浓度（图 10 G）。使用 HSA 模型，协同评分为负，显示拮抗作用（图10H）。这些结果表明，尽管这些参考模型在大多数情况下产生相似的结果，但协同评估模型的选择可以给出关于药物组合协同评估的略有不同的结果。

图 9. Bliss（左）和 HAS（右）5-FU 加拉曲吡定（A、B）、硫利达嗪（C、D）、舍曲林（E、F）和甲氟喹（G、H）的协同作用图。

图 10. Bliss（左）和 HAS（右）5-FU 加氟奋乃静（A、B）、氟西汀（C、D）、苯托品（E、F）和青蒿琥酯（G、H）的协同作用图。

2.1.5。5-FU与不同中枢神经系统药物和抗疟药的不同组合方案的效果
根据 MTT 测定结果（图 6），5-FU 与氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的组合似乎证明了这两种药物之间存在某种竞争，组合的结果比改用药物的结果更差独自的。我们为这对药物设计了一个新的组合模型，并评估了药物时间表对 HT-29 的影响。我们假设如果我们在不同时间（连续）给药，结果会更好，因为两种药物之间不竞争。为此，我们测试了三个时间表（图 11)：同时给药（附表A）、药物A在先药物B（附表B）和药物B在先药物A（附表C）。我们发现，对于所有 CNS 药物，与其他方案相比，同时给药在降低细胞活力方面产生了更好的结果（图 12 A-F）。有趣的是，我们发现所有中枢神经系统药物单独表现出比联合使用更好的抗肿瘤活性，表明这些药物是药物再利用的理想候选者。对于青蒿琥酯，我们发现在 5-FU 之前给予青蒿琥酯比其他药物方案产生更好的结果（图 12 G，H）。

图 11. 用于评估 5-FU 与氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯组合的三种组合方案。附表 A 代表同时用 5-FU 和每种重新利用的药物处理 48 小时的细胞。附表 B 代表用 5-FU 预处理 24 小时的细胞，然后每种重新利用的药物再处理 24 小时。对于计划 C，细胞用每种重新利用的药物预处理 24 小时，然后用 5-FU 再处理 24 小时。

图 12.使用恒定比例的 IC 50剂量 将 HT-29 细胞暴露于连续的 5-FU 和 ( A , B ) 氟奋乃静 ( C , D ) 氟西汀 ( E , F ) 苯托品和 ( G , H ) 青蒿琥酯。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）。
2.1.6。5-FU和CNS药物/抗疟药不同组合方案的协同作用评价
基于先前的结果，我们还分析了这些组合中的药物相互作用，以评估三种给药方案之间的 CI 值是否存在差异。对于氟奋乃静，药物的同时给药和顺序给药之间没有差异，并且所有对都是拮抗剂（图13A）。对于氟西汀，同时给药中只有一对具有协同作用，而在顺序给药中，看不到协同作用，因此同时组合似乎优于顺序(图13B )。对于苯托品也观察到同样的情况，表明序贯给药缺乏疗效（图 13C）。与这些药物相反，以序贯形式与青蒿琥酯组合，在 5-FU 之前给予青蒿琥酯，与 5-FU 之前的青蒿琥酯和同时给药相比，似乎具有更好的结果，产生三对协同作用（CI < 1）（图 13 D)。表 4显示了每种组合获得的 CI 值，具体取决于药物方案。

图 13. 5-FU 加氟奋乃静 ( A )、氟西汀 ( B )、苯托品 ( C ) 和青蒿琥酯 ( D ) 的三种时间表依赖性组合的 Chou-Talalay 法 Fa-CI 图。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。CI < 1、CI = 1 和 CI > 1 分别是指协同作用、相加作用和拮抗作用。
表 4. 5-FU 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的三种不同组合方案的 CI 值和各自的分数效应。红色的 CI 表示具有协同作用的药物对的浓度。

2.2. MCF-7 乳腺癌细胞
2.2.1。中枢神经系统药物作为单一药物对细胞活力的影响
最后，我们评估了最有希望的 CNS 药物在 MCF-7 乳腺癌细胞中的细胞毒作用，包括单独和联合使用。这一次，我们将这些药物与紫杉醇 (PTX) 结合使用，这是一种用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药物，而不是 5-FU，因为我们小组之前的结果表明这种药物对 MCF-7 乳腺癌不是很有效癌细胞。基于 HT-29 结果，我们选择了硫利达嗪、苯托品、氟西汀、氟奋乃静、舍曲林和拉曲吡定，并评估了它们对 MCF-7 活力的影响。如前所述，MCF-7 细胞用增加浓度的每种再利用药物进行处理，从 1 μM 到 100 μM 开始，以评估处理 48 小时后的细胞活力。
基于 MTT 结果，我们发现所有测试的 CNS 药物在 MCF-7 细胞中均显示出显着的抗肿瘤活性。氟西汀的细胞毒性效应（图 14 A）在浓度高于 10 µM 时显着，7.78 µM 导致超过 50% 的细胞减少（图 14 B）。在所有单独测试的药物中，舍曲林的抗肿瘤作用最强，10 µM 以上的浓度几乎杀死了所有细胞（图 14 C）。舍曲林的 IC 50值最低，即约 2.22 µM（图 14 D）。硫利达嗪的 MTT 结果表明，该 CNS 药物在 HT-29 细胞中对所有超过 10 µM 的测试浓度都具有强烈的细胞毒性作用（图 14E)。硫利达嗪的剂量反应曲线导致 IC 50值为 5.72 µM（图 14 F）。氟奋乃静在浓度高于 10 µM 时显示出与舍曲林相似的显着抗肿瘤作用（图 14 G），获得的 IC 50值为 2.68 µM（图 14 H）。Benztropine 和 latrepirdine 对 MCF-7 活力的影响是所有测试药物中最差的。对于高于 15 µM 的所有浓度（图 14 I）和 21.71 µM 的 IC 50值（图14），苄托品治疗显着降低了 MCF-7 乳腺癌细胞活力J)。只有以高于 25 µM 的剂量使用拉曲吡定处理 48 小时对细胞活力有显着影响（图 14 K），导致 IC 50值超过 70 µM（图 14 L）。

图 14. 一些 CNS 药物对 MCF-7 细胞的影响。( A ) 氟西汀对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。( C )舍曲林对细胞活力和( D )剂量反应曲线的影响。（E）硫利达嗪对细胞活力的影响和（F）剂量反应曲线。（G）氟奋乃静对细胞活力的影响和（H）剂量反应曲线。( I ) 苯托品对细胞活力的影响和 ( J ) 剂量反应曲线。( K ) latrepirdine 对细胞活力的影响和 ( L) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。
这些结果表明，CNS 药物，例如氟西汀、舍曲林、苯托品、氟奋乃静和硫利达嗪，是与 PTX 联合使用的良好候选者。表 5显示了这些药物在两种细胞系（MCF-7 和 HT-29）中获得的 IC 50之间的比较。与之前的结果相比，可以验证 MCF-7 乳腺癌细胞获得的所有 IC 50值均高于 HT-29 结肠癌细胞获得的 IC 50 值，舍曲林除外，这表明单独使用这些药物的效力较低在乳腺癌细胞中。
表 5.几种 CNS 药物对 HT-29 和 MCF-7 癌细胞的 IC 50 比较。IC 50值作为平均值给出。

2.2.2。PTX和不同CNS药物的各种组合的效果
接下来，我们使用我们之前工作中开发的组合模型评估了 PTX 与每种药物的组合 [ 37 ]。这些药物组合中采用的 PTX的 IC 50值是在我们之前的工作中获得的 [ 37 ]。MCF-7细胞用两种药物单独或以固定比例组合处理，浓度分别为0.25×IC 50、0.5×IC 50、IC 50、2×IC 50和4×IC 50，并进行了两种基于细胞的测定：MTT 和 SRB。还对用每种药物单独和组合处理的细胞进行了形态学评估。评估了 PTX 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪和舍曲林的组合。当与 PTX 联合使用时，氟西汀通过 MTT 和 SRB 测定显示出显着的抗癌作用（分别为图 15 A、B），主要在 2 × IC 50的浓度下，与单独的每种药物相比，联合作用具有统计学意义. 在所有浓度下，与舍曲林的组合导致细胞活力和细胞蛋白质合成的降低与单独的 PTX 相似。在 IC 50和 2 × IC 50的浓度下与单独的舍曲林相比，PTX加舍曲林的组合显示出显着的抗癌作用（图15 C，D）。在 IC 50和 2 × IC 50的浓度下，与两种药物单独相比，与 PTX 和硫利达嗪的组合显示出显着的抗癌作用（图 15 E、F）。与氟奋乃静的组合导致所有中间浓度显示出比单独使用氟奋乃静更大的抗癌作用（图15 G，H）。这些组合的活性可能是单独使用 PTX 的强抗癌活性的结果。与苯托品的组合导致在 IC 50浓度下细胞活力在统计学上显着降低和 2 × IC 50与单独的 PTX 相比（图 15 I，J），表明这种组合的活性可能是单独重新利用药物的结果，与之前的组合相反。总之，这些结果表明 CNS 药物和 PTX 在联合作用中可以具有不同的药理作用。形态学上，结果与 MTT 和 SRB 测定一致。在 4 × IC 50的浓度下，与对照细胞和 PTX 相比，所有组合都导致细胞数量减少，细胞更小更圆，这表明细胞死亡（图 16）。

图 15. 与 PTX 联合治疗 48 小时后 MCF-7 的生长抑制，通过 MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于浓度为IC 50 0.25、0.5、1、2和4倍的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) PTX 加氟西汀对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) PTX 加舍曲林对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) PTX 加硫利达嗪对细胞活力的影响和 ( F) 细胞蛋白质合成。( G ) PTX 加氟奋乃静对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。( I ) PTX 加苯托品对细胞活力和 ( J ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。

图 16.与载体 ( A )、PTX ( B )、氟西汀 ( C )、氟西汀 + PTX ( D )、舍曲林 ( E )、舍曲林 + PTX ( F ) 孵育 48 小时后 MCF-7 细胞的显微细胞可视化、硫利达嗪 ( G )、硫利达嗪 + PTX ( H )、氟奋乃静 ( I ) 氟奋乃静 + PTX ( J )、苯托品 ( K ) 和苯托品 + PTX ( L )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。比例尺：50 µm。
2.2.3。PTX 和 CNS 药物的协同组合
接下来，我们使用 CompuSyn 软件使用 Chou-Talalay 方法计算组合指数 (CI)。PTX加氟西汀的组合在最低浓度下与三个协同对（图17A）表现出协同作用，Fa值为0.1184、0.2472和0.3621（表6）。对于最低浓度，与舍曲林的组合仅产生一对协同作用(图17B )。PTX加硫利达嗪的组合对两对表现出协同作用（图17C），Fa值为0.1895和0.5027（表6）。与氟奋乃静和苯托品组合产生三对协同作用（分别为图 17 D、E），Fa 值低于 0.60（表 6）。总之，这些结果表明，这些 CNS 药物可能是在未来组合中评估的有希望的候选者。

这些药物相互作用也通过 Bliss Independence 方法使用 SynergyFinder 2.0 软件进行了评估。用 Bliss 模型分析的氟西汀与 PTX 的组合（图 18A）证明了最高的协同作用评分，与 Chou-Talalay 结果一致，表明三对的协同作用。舍曲林组合使用 Bliss 模型显示出协同作用，协同作用得分为 2.127（图18B ）。PTX与硫利达嗪的组合也导致使用Bliss方法(图18C)的协同作用，协同作用得分为2.938。PTX 加氟奋乃静和苯托品的组合使用 Bliss 方法产生的协同作用得分最低，得分为 0.569 和 -8.262（图 18D，E，分别）。

图 18. PTX 与氟西汀 ( A )、舍曲林 ( B )、硫利达嗪 ( C )、氟奋乃静 ( D ) 和苯托品 ( E ) 的 Bliss 协同作用图。
Bliss 方法的结果表明，与 Chou-Talalay 结果相比，药物组合的协同作用评估结果略有不同，尤其是氟奋乃静和苯托品组合。尽管如此，这些参考模型在大多数情况下都会产生类似的结果。

3. 讨论
   药物再利用和药物组合是多年来越来越流行的策略，代表了一种更快、更便宜的策略来识别癌症治疗的新潜在候选者。市场上已经有针对其他疾病的再利用药物，并且具有完善的药代动力学、药效学和毒理学特征，有助于它们获得新适应症的批准。药物的组合允许减少治疗剂量，减少药物的副作用。几项研究已经探索了抗肿瘤药物与其他药物类别的组合，但很少有研究报告中枢神经系统药物对癌症治疗的益处，无论是单独的还是联合的。5-FU是治疗CRC的重要药物，但其使用受限于其短半衰期，高细胞毒性和低生物利用度限制了其益处。PTX是一种常用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药物，但其最大治疗剂量受到耐药性和副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。但其最大治疗剂量受到耐药性及其副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。但其最大治疗剂量受到耐药性及其副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。
   我们研究了不同 CNS 药物在 HT-29 结肠和 MCF-7 乳腺癌细胞中的潜在抗癌活性，并评估了此类药物与 5-FU 或 PTX（用于 CRC 和乳腺癌治疗的抗肿瘤药物）的潜在协同作用，分别。首先，通过 MTT 法筛选了几种用于治疗 HT-29 和 MCF-7 细胞的 CNS 药物，以评估它们作为再利用药物的潜力。除了中枢神经系统药物外，我们还在本研究中根据我们之前在 MCF-7 细胞中的结果评估了三种抗疟疾药物（氯喹、青蒿琥酯和甲氟喹），以评估它们的抗癌行为是否在不同的细胞系 (HT-29) 中保持。在使用 MTT 进行评估后，确定了每种药物的IC 50以及具有 IC 50的药物根据细胞类型，选择低于 20 µM 与 5-FU 或 PTX 组合。我们采用了我们之前描述的组合模型，其中使用 MTT 和 SRB 测定法单独或联合使用每种药物的 IC 50的 0.25、0.5、1、2 和 4 倍的浓度处理细胞。我们接下来通过三种不同的方法评估协同作用：Chou-Talalay、Bliss（用于 HT-29 和 MCF-7 细胞）和 HSA（仅用于 HT-29 细胞）。Chou-Talalay 方法基于中值效应方程，源自质量作用定律原理。这个统一的理论涵盖了生物化学和生物物理学中的 Michaelis-Menten、Hill、Henderson-Hasselbalch 和 Scatchard 方程，并为药物中的加性效应 (CI = 1)、协同作用 (CI < 1) 和拮抗作用 (CI > 1) 提供了定量定义组合 [58 ]。Bliss独立模型采用两种药物独立产生作用的随机过程，可以根据独立事件发生的概率计算出预期的联合作用[ 57 ]。HSA 模型是协同作用评估最简单的参考模型之一，并指出预期的联合效应是相应浓度下单一药物反应的最大值。药物组合的协同作用得分是所有剂量组合测量值的平均值，给出正值或负值，分别对应于协同作用或拮抗作用。2D 和 3D 协同图分别以红色和绿色突出显示协同和拮抗剂量区域。
   我们的研究结果表明，作为单一药物的 CNS 药物能够在两种细胞系中以浓度依赖性方式降低细胞活力。在 HT-29 结肠癌细胞中，最有希望的药物是拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯，它们的 IC 50值均低于 20 µM，其中氟奋乃静最有效，IC 50为 1.86微米。对于 MCF-7 乳腺癌细胞，我们发现这些药物效力较低，IC 50值高于结肠癌细胞，但舍曲林除外，其 IC 50为 2.22 µM。
   在同时组合中，我们发现舍曲林和硫利达嗪是提高 5-FU 在 HT-29 结肠癌细胞中抗癌活性的最有希望的候选药物。对于 MCF-7 细胞，几乎所有测试的组合都产生协同作用对，浓度最低。与使用改用药物或 PTX 进行单一治疗相比，氟西汀和硫利达嗪等药物与 PTX 联合使用会导致 MCF-7 细胞活力的降低。与 HT-29 细胞相比，CNS 药物与 PTX 在 MCF-7 中的组合显示出比 5-FU 更多的协同相互作用，除了舍曲林。奇怪的是，当单独在 MCF-7 中进行测试时，舍曲林是最有效的再利用药物，但它与 PTX 的组合只产生了一对协同作用。共，
   特别是对于 HT-29 细胞中的氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯，我们发现这些药物与 5-FU 的组合导致比单独使用再利用药物的结果更差，可能是由于两种药物之间的竞争，因此我们设计了基于两种药物顺序添加的药物组合模型，间隔为24小时。对于大多数药物，我们没有发现药物时间表之间的显着差异，除了青蒿琥酯，我们发现青蒿琥酯在 5-FU 给药之前导致抗癌作用增强。对于氟奋乃静、氟西汀和苯托品，我们发现这些药物单独作用比联合作用更好，是药物再利用的理想候选者。这些结果首次表明，CNS 药物可能是结肠癌和乳腺癌治疗中药物再利用的潜在候选者。我们发现，当与 PTX 联合使用时，所有测试的 CNS 药物都可以协同降低 MCF-7 细胞活力，氟西汀、苯托品和氟奋乃静是低浓度下最有希望的药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。苯托品和氟奋乃静是最有希望的低浓度药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。苯托品和氟奋乃静是最有希望的低浓度药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。
   从机制上讲，几项研究表明，与 5-FU 联合治疗可协同诱导结肠癌细胞凋亡 [ 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 ]。尽管诱导细胞凋亡，但观察到的协同效应也可能是对自噬的综合影响的结果，自噬是细胞中响应压力条件（例如营养缺乏或蛋白质/DNA损伤）而发生的分解代谢过程，最终可能引发细胞死亡。事实上，在人类结肠癌细胞系和结直肠癌异种移植小鼠中，舍曲林通过丝裂原活化蛋白激酶级联激活和Bcl-2抑制表现出促凋亡活性 [ 65]。关于硫利达嗪，最近发现该药物显着抑制结肠癌干细胞的增殖和侵袭，并以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。发现治疗后Bax、caspase-3等凋亡基因过表达，抗凋亡基因Bcl-2下调。因此，这些细胞的线粒体电位被下调 [ 66]。基于这些文献发现，我们建议在我们的组合中同时发生细胞凋亡和自噬性细胞死亡。我们认为，5-FU 联合舍曲林和硫利达嗪主要增加了 HT-29 细胞中 caspase-3 酶和其他凋亡蛋白的浓度，导致细胞凋亡依赖性细胞死亡。在结肠细胞中 5-FU 和这些 CNS 药物联合治疗的情况下，这种自噬抑制和细胞凋亡诱导可被认为是协同作用的基础。
   关于 MCF-7 结果，氟西汀、氟奋乃静和苯托品联合 PTX 是最有希望的组合。PTX 属于紫杉烷类药物，通过稳定微管来阻断细胞有丝分裂，导致细胞周期优先停滞在 G2/M 期和细胞凋亡 [ 67 ]。一些研究表明，作用于血清素 (5-HT) 信号传导的药物，包括选择性血清素再摄取抑制剂 (SSRIs)，可在体外和体内模型中抑制人乳腺肿瘤细胞中的肿瘤球形成 [ 68 ]。特别是，氟西汀被发现通过分别诱导细胞凋亡和自噬介导的细胞死亡或内质网应激和自噬来显着降低几种乳腺癌细胞系的增殖。68、69、70、71 ]。_ _ _ _ _ 在三阴性乳腺癌细胞中，氟奋乃静抑制乳腺癌细胞生长，诱导 G0/G1 细胞周期停滞，并诱导线粒体介导的乳腺癌细胞凋亡 [ 72 ]。在 MCF-7 细胞的情况下，由于它们不表达 caspase-3，它们不会发生正常的细胞凋亡，自噬可以代表主要的替代细胞死亡途径 [ 73 ]。最近的研究表明，苯托品降低了 MMP9 的致癌信号转导和反式激活因子的活性，包括 STAT3、NF- κ B 和 β-连环蛋白 [ 74]。我们认为 PTX 与 CNS 药物联合的协同作用机制可能与增强细胞周期停滞、干扰重要的致癌信号和增加自噬介导的细胞死亡有关。我们还认为，中枢神经系统药物可以通过减缓药物流出、增加药物积累来充当化学增敏剂。由于几种中枢神经系统药物是 P-糖蛋白 (P-gp) 蛋白的底物和调节剂 [ 75 , 76 , 77 ]，我们也相信它们可以抑制 P-gp 阻止药物从细胞内流出，从而增加细胞内抗癌药物的浓度PTX 等药物。
   这些结果表明，中枢神经系统药物可能是有前景的化学增敏剂化合物，并分别增强 5-FU 和 PTX 在 HT-29 和 MCF-7 癌细胞中的细胞毒作用。由于这些药物已经在市场上销售，因此它们用于癌症治疗是可以实现的。由于不同的结肠癌细胞系代谢不同，具有特定的特征，因此应该对其他结肠癌细胞进行更多的研究，如HCT116、SW480、LoVo等。乳腺癌细胞也是如此，这些组合可以进一步在其他细胞系如肿瘤 MDA-MB-231 细胞或正常 MCF-10A 细胞中进行了探索。强烈建议进行更深入的机制研究来评估这些药物和这些组合的抗癌机制。这类药物也应该单独和联合用于其他类型的癌症，如胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。这些都是有希望的结果，应该在动物模型和临床试验中进一步证实。我们的研究结果表明，单独或联合使用中枢神经系统和抗疟疾药物可能会为结肠癌和乳腺癌的治疗带来新的治疗策略。
   四、材料与方法
   4.1。材料
   McCoy 的 5A 改良培养基、Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS) 和青霉素-链霉素溶液购自 Millipore Sigma (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。其他细胞培养试剂购自 Gibco (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)。5-FU（货号 F6627）、司来吉兰（货号 M003）、恩他卡朋（货号 SML0654）、托卡朋（货号 SML0150）、拉替匹定（货号 D6196）、氟奋乃静（货号. no. F4765)、safinamide (cat. no. SML0025)、carbidopa (cat. no. PHR1655)、东莨菪碱 (cat. no. S1013)、噻唑蓝四唑溴化物 (MTT, cat. no. M5655) 和 sulforhodamine B ( SRB, cat. no. S1402) 购自 Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。苄托品（货号 16214）、硫利达嗪（货号 14400）、氟西汀（货号 14418）和青蒿琥酯（货号 11817) 购自 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)。Nepicastat（目录号 5037）和紫杉醇（目录号 1097）购自 Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。甲氟喹（货号 sc-211784）和氯喹（货号 C6628）购自 Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。溴隐亭用于片剂，并在制备原液前用水稀释。
   4.2. 细胞系和细胞培养
   人结肠直肠癌 HT-29 和乳腺癌 MCF-7 细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC；马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国），并根据 ATCC 的建议在 37 °C 和 5% CO 2下维持在适当的培养基中添加 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素 G 和 100 µg/mL 链霉素。细胞始终保持在对数生长期。每 2 天更换一次培养基并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行胰蛋白酶处理。将总共 200 µL HT-29 细胞（7500 个细胞/孔）或 MCF-7 细胞（5000 个细胞/孔）接种在 96 孔板中，并在药物暴露前使其粘附过夜。24 小时后，将细胞培养基更换为 200 µL 含药物培养基。将细胞暴露于药物 48 小时，然后进行 MTT 和 SRB 测定以评估这些细胞的细胞活力和蛋白质合成率的单一和联合药物治疗。
   4.3. 药物治疗
   首先在 HT-29 和 MCF-7 细胞中单独测定每种药物的半数最大抑制浓度 (IC 50 ) 值。单药治疗的药物浓度范围为 0.1 至 100 µM。通过根据每个细胞系将 5-FU 或 PTX（药物 A）与不同的再利用药物（药物 B）组合来进行组合研究。药物 A 对于 HT-29 细胞是 5-FU，对于 MCF-7 细胞是 PTX。按照时间表 A（图 11 ），仅对呈现最有希望的药理学特征（IC 50 < 20 µM）的药物与 5-FU 或 PTX 同时进行测试。药物 A 和药物 B 的浓度都是可变的，并且 IC 50的等效浓度（固定比率）的综合效应评估每种药物的值。氟西汀、氟奋乃静、苯托品和青蒿琥酯与 5-FU 的组合也在顺序给药方案中进行了测试（附表 B 和 C，图 11）。对于时间表 A，细胞同时用 5-FU 或 PTX 处理，每种重新利用的药物持续 48 小时。对于方案 B，细胞用 5-FU 预处理 24 小时，然后每种重新利用的药物 24 小时。对于计划 C，细胞用每种重新利用的药物预处理 24 小时，然后用 5-FU 再处理 24 小时。
   4.4. 细胞活力测定
   为了分别确定 5-FU 或 PTX 和改用药物对 HT-29 和 MCF-7 细胞活力的影响，使用了 MTT 和 SRB 测定。对于 MTT 方案，在药物处理后，去除细胞培养基并添加 100 µL/孔的 MTT 溶液（0.5 mg/mL 在 PBS 中）。将细胞孵育3小时，避光。此后，除去 MTT 溶液，加入 DMSO (100 µL/孔) 以溶解甲臜晶体。在自动酶标仪（Tecan Infinite M200，Tecan Group Ltd.，Männedorf，Switzerland）中在 570 nm 处测量吸光度。对于 SRB 测定，处理后，培养的细胞用冰冷的 10% 三氯乙酸固定 30 分钟，并在室温下用 0.4% SRB 染色 1 小时。通过用自来水冲洗数次去除多余的染料。用 200 µL 10 mM Tris 碱溶液溶解蛋白质结合染料，用滤光片波长为 540 nm 的酶标仪（Tecan Infinite M200，Tecan Group Ltd.，Männedorf，Switzerland）测定吸光度。集成电路50的治疗药物被确定为每种药物浓度与对照相比显示出 50% 的细胞生长抑制。所有条件均独立进行三次，一式三份。
   4.5. 细胞形态可视化
   每次处理后，在配备 Leica DFC350 FX 相机的 Leica DMI 6000B 显微镜上评估细胞形态，然后使用 Leica LAS X 成像软件 (v3.7.4) 进行分析。
   4.6. 数据分析
   GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 用于通过非线性回归分析生成浓度响应曲线。将用每种药物处理的细胞的活力标准化为对照细胞的活力，并以对数标度绘制细胞活力分数与药物浓度的关系。
   4.7. 药物相互作用分析
   为了量化 5-FU 和 CNS 药物之间的药物相互作用，我们首先使用 CompuSyn 软件（ComboSyn, Inc., New York, NY, USA）。我们使用互斥模型，假设药物通过完全不同的机制发挥作用 [ 78 ]。两种药物以对应于单个IC 50值的0.25、0.5、1、2和4倍的固定剂量比例组合。CI 绘制在y轴上，作为x上效应水平 (Fa) 的函数轴来评估药物组合之间的药物协同作用。CI 是药理相互作用的定量表示。CI < 1 表示协同作用，CI = 1 表示加性相互作用，CI > 1 表示拮抗作用。我们还使用 SynergyFinder [ 57 ]基于最高单剂 (HSA) 和 Bliss 参考模型估计了预期的药物组合反应。具有正值和负值的观察到的和预期的响应之间的偏差分别表示协同作用和拮抗作用。
   4.8. 统计分析
   结果表示为进行的 n 次实验的平均值 ± SEM。所有数据均在三个独立的经验中进行分析，一式三份。在同一时间点，对照组和治疗组之间的统计比较采用学生t检验和单因素方差分析检验。在p值 < 0.05时接受统计显着性。
   作者贡献
   概念化，内华达州；方法论、DD、AC 和 NV；软件，DD；验证、AC 和 NV；形式分析、DD、AC 和 NV；调查、DD、AC 和 NV；资源、AC 和 NV；数据管理，DD；写作——原稿准备，DD；写作——评论和编辑，AC 和 NV；可视化、AC 和 NV；监督，内华达州；项目管理，内华达州；资金收购、AC 和 NV 所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
   资金
   本研究由 FEDER- Fundo Europeu de Desenvolvimento 区域基金通过 COMPETE 2020-竞争力和国际化运营计划 (POCI) 和葡萄牙 2020 以及葡萄牙基金通过Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT) 资助。项目 IF/00092/2014/CP1255/CT0004。
   机构审查委员会声明
   不适用。
   知情同意声明
   不适用。
   数据可用性声明
   不适用。
   致谢
   本文通过 FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP 获得国家基金的支持，隶属于 CINTESIS 研发部门（参考 UIDB/4255/2020）。DD 承认 FCT 资助她的博士奖学金 (SFRH/BD/140734/2018)。
   利益冲突
   作者宣称没有利益冲突。

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