by Hu Ma 1,2,Quan Yao 1,An-Mei Zhang 1,Sheng Lin 1,Xin-Xin Wang 1,Lei Wu 1,Jian-Guo Sun 1,* andZheng-Tang Chen 1,*
1.第三军医大学新桥医院解放军肿瘤研究所，重庆市新桥街2号 400037
2.遵义医学院附属医院肿瘤科,遵义 563000
*应向其通信的作者。

Molecules 2011, 16(12), 10556-10569; https://doi.org/10.3390/molecules161210556
Received: 31 October 2011 / Revised: 25 November 2011 / Accepted: 5 December 2011 / Published: 19 December 2011

抽象的Abstract
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的主要原因。临床和实验室研究表明，针对肿瘤细胞的多靶点方法可以帮助提高患者的存活率，并可能减少对单靶点抑制剂耐药的细胞的出现。青蒿琥酯 (ART) 是已知的最有效、作用最迅速的抗疟药之一，它还对癌细胞具有深远的细胞毒活性并逆转多药耐药性。在本研究中，我们发现青蒿琥酯在 A549 细胞和小鼠异种移植模型中以剂量依赖性方式抑制 NSCLC A549 细胞生长和增殖、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长。此外，青蒿琥酯下调表皮生长因子受体（EGFR）的表达，体外和体内。总之，青蒿琥酯是一种有效的抗癌药物，可以增强其他抗癌药物的疗效，并可能通过抑制ABCG2的转录来逆转多药耐药，从而抑制药物流出。
Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death worldwide. Clinical and laboratory studies have suggested that multi-targeting approaches against neoplastic cells could help to increase patient survival and might reduce the emergence of cells that are resistant to single-target inhibitors. Artesunate (ART) is one of the most potent and rapidly acting antimalarial agents known, and it also exerts a profound cytotoxic activity toward cancer cells and reverses multi-drug resistance. In the present study, we found that artesunate inhibited NSCLC A549 cell growth and proliferation, induced apoptosis and suppressed tumor growth in a dose-dependent manner in A549 cells and a mouse xenograft model. Furthermore, artesunate down-regulated the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), Akt and ATP-binding cassette subfamily G member 2 (ABCG2) at the mRNA and protein levels in vitro and in vivo. In conclusion, artesunate is an effective anti-cancer drug that may enhance the effectiveness of other anticancer drugs and may reverse multi-drug resistance by suppressing the transcription of ABCG2, which inhibits drug efflux.

一、简介
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的主要原因。尽管近年来肺癌的检测和治疗取得了进展，但中国的总体五年生存率仍低于 15%。大多数患者从标准的铂类化疗治疗中获得适度的临床益处，这与总生存期的有限增加有关 [ 1 ]。表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 吉非替尼和厄洛替尼 (特罗凯) 在对化疗后的 NSCLC 患者给药时可适度增加生存率。研究表明，接受这些药物治疗的一部分 NSCLC 患者进入缓解期 [ 2 , 3]。值得注意的是，这种反应与 EGFR 激酶结构域中存在的体细胞激活突变相关 [ 4 , 5 ]。然而，尽管厄洛替尼和吉非替尼对 EGFR 突变的 NSCLC 患者有效，但所有患者最终都会对这些药物产生耐药性。
由于肿瘤的耐药性，EGFR TKI 的临床应用仍然具有挑战性，这导致患者预后不良。迫切需要了解耐药性的分子机制并开发新的治疗策略。一类 ATP 结合盒蛋白包括 P-糖蛋白、几种多药耐药蛋白和 ABCG2 蛋白（也称为 BCRP/MXR/ABCP）被怀疑赋予耐药性。这些蛋白质通过积极地从细胞中排除多种抗癌药物而导致肿瘤的多药耐药性 [ 6 , 7 , 8].这些蛋白质被认为是潜在的临床靶点，可抑制多药耐药性，并改变各种化疗药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性[ 9 , 10 ]。ABCG2 是米托蒽醌、拓扑替康和黄吡酮的主要活性转运蛋白，其过表达已在几种耐药细胞系和肿瘤中得到证实 [ 6 , 11 , 12 , 13 ]。ABCG2 在来自不同组织类型的各种药物选择的肿瘤细胞系中表达，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和胃癌、纤维肉瘤和骨髓瘤 [ 14]。ABCG2 也被证明能以高亲和力结合吉非替尼，导致 EGFR 抑制剂的主动挤出并阻止其生物活性 [ 15 ]。
新的临床和实验研究表明，针对肿瘤细胞的多靶点方法可以提高患者的存活率，并可能减少对单靶点抑制剂耐药的细胞的出现 [ 16 ]。
据报道，青蒿提取物具有多种药理活性，如免疫刺激、抗炎、抗肿瘤发生和抗血管生成。这种提取物中的主要活性成分之一青蒿琥酯 (ART)在体内显示出抗癌活性，并已成功用于治疗转移性黑色素瘤患者 [ 17 ]。先前的研究表明，ART 可在细胞内迅速转化为活性氧，从而破坏细胞功能 [ 18 ]。ART 还被证明可以改变主要的信号通路 [ 19 ]、抑制转移 [ 20 ]、诱导 DNA 损伤 [ 21 ]]，改变细胞周期和逆转多药耐药性 [ 22 , 23 ]。然而，导致细胞死亡和逆转与 ART 相关的多药耐药性的明确机制尚未阐明。
迄今为止，探索 ART 作为组合药物或治疗方案中耐药性抑制剂的功效机制的已发表数据有限，而现有研究仅检查了 ART 与其他药物的相互作用。因此，本研究旨在探索 ART 的抗癌活性，并探讨 ART 对 A549 人肺癌细胞和小鼠异种移植模型中 EGFR 和 ABCG2 表达的影响。

2. 结果与讨论
   2.1。ART 抑制 A549 细胞系的生长和增殖
   为了确定 ART 对 A549 细胞生长的影响，将细胞在 96 孔板中培养并用 ART 处理 24、48、72 和 96 小时。使用 MTT 测定法确定活细胞的数量。OD值随着ART浓度和暴露时间的增加而降低（与对照组相比，p <0.05）。从 OD 值计算抑制百分比。结果表明，ART对A549细胞的生长具有浓度和时间依赖性抑制作用（图1A）。

图 1. 青蒿琥酯 (ART) 在人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞中的细胞毒性。( A ) 描述了暴露于指定浓度 ART 24、48、72 和 96 小时的 A549 细胞的生长抑制曲线和三个独立细胞活力 MTT 测定的平均值；( B ) 用Annexin V-FITC和PI进行细胞染色后，通过流式细胞仪分析确定凋亡细胞的百分比。在 37°C 下用不同浓度的 ART 处理细胞 48 小时。显示的数据代表从三个独立实验中获得的平均值 ± SE。*与对照组相比，p < 0.05。

2.2. ART 以剂量依赖性方式诱导 A549 细胞凋亡
为了研究 ART 诱导的细胞死亡机制，对用 ART (25–100 μM) 处理 48 小时的细胞进行流式细胞术分析。凋亡 A549 细胞的百分比随着 ART 浓度的增加而增加：在 25 μM ART 处理后，8.30% ± 3.45% 的细胞发生凋亡，而在 100 μM ART 处理后为 32.3% ± 11.98%（图 1B）。
2.3. ART 对肺癌细胞 ABCG2 和 EGFR mRNA 水平的影响
A549 细胞用 25-100 μM ART 处理 48 小时，洗涤，并使用实时 RT-PCR 分析 EGFR 和 ABCG2 的 mRNA 表达。当 A549 细胞用低和中等浓度的 ART（25 和 50 μM）处理 48 小时时，EGFR 的 mRNA 表达略有下调。然而，当 ART 浓度增加到 100 μM 时，EGFR 的表达与对照组相比显着下调（p < 0.05）。相比之下，中高浓度 ART（50 和 100 μM）观察到 ABCG2 mRNA 表达下调（p < 0.05），尽管低浓度 ART（25 μM）不影响表达（图 2一种）。

图 2. ART 下调 A549 细胞中的 EGFR 和 ABCG2 mRNA 和蛋白质水平。( A ) 用不同浓度的 ART 处理细胞 48 小时，然后收获。使用实时RT-PCR检测EGFR和ABCG2 mRNA水平；( B ) EGFR、p-EGFR Akt、p-Akt 和 ABCG2 的表达通过蛋白质印迹分析测量。用不同浓度的 ART 处理 A549 细胞 48 h，然后使用 β-actin 表达作为内部对照来确定蛋白质的表达水平。观察到所有蛋白质的显着下调。印迹代表三个独立实验。数据代表一式三份进行的三个独立实验的平均值±SE。* p< 0.05 与对照组相比。

2.4. ART 对肺癌细胞 EGFR、Akt 和 ABCG2 蛋白水平的影响
为了确定细胞凋亡是否与重要的细胞生长信号通路的抑制有关，进行了蛋白质印迹分析。因为 A549 细胞表达 EGFR，我们在 ART 暴露 48 小时后确定了 EGFR 的磷酸化状态。ART 降低 EGFR、EGFR 磷酸化并阻止下游激酶 Akt 的激活。Akt 和 ABCG2 的磷酸化以浓度依赖性方式降低（图2B）。上述结果表明，细胞生长的抑制可能与A549细胞中促存活信号的抑制有关。药物的协同作用可以通过抑制 ABCG2 表达来解释，这将阻止药物通过 ABCG2 的细胞外排。
2.5. ART 抑制小鼠异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长
为了确定 ART 是否对肺癌治疗具有潜在的治疗价值，我们在无胸腺小鼠异种移植模型中进一步测试了 ART 对 A549 细胞的抑制作用。将A549细胞（每只小鼠1×10 6 个细胞）皮下注射到三组小鼠中：蒸馏水对照组和两个ART组（60 mg·kg -1或120 mg·kg -1，n = 5）。每隔一天进行最长垂直肿瘤直径的卡尺测量以估计肿瘤体积。结果表明，120 mg·kg -1 ART显着抑制( P < 0.05)肿瘤生长(图3A )。这些发现表明，ART 可有效抑制体内肺肿瘤的生长。

图 3. ART 抑制 A549 异种移植物中的肿瘤生长以及 EGFR 和 ABCG2 mRNA 水平。( A ) 探讨了ART对A549人非小细胞肺癌异种移植小鼠平均肿瘤体积的影响。小鼠每天用0、60和120 mg·kg -1的口服ART治疗14天。每周测量肿瘤大小 3 次。呈现的体积是来自 5 只小鼠的平均值；( B ) ART 治疗小鼠的体重与生理盐水对照组相似；( C ) 在 A549 异种移植物中测量 EGFR 和 ABCG2 mRNA 的表达。小鼠每天口服 60 mg·kg -1 ART, 120 mg·kg -1ART 或蒸馏水。使用实时 RT-PCR 测量 EGFR 和 ABCG2 mRNA 表达水平。*与对照组相比， p < 0.05。

2.6. ART 抑制体内 EGFR、Akt 和 ABCG2 蛋白和基因表达
进一步的研究揭示了口服青蒿琥酯对 EGFR 和 ABCG2 蛋白和基因表达的体内抑制。与对照组相比，接受60 mg·kg -1 ART治疗的小鼠EGFR mRNA表达略有下调( p > 0.05)。然而，与对照组相比，120 mg·kg -1 ART组小鼠的EGFR mRNA表达显着下调（ p < 0.05）。相比之下，两种剂量的 ART（60 和 120 mg·kg -1）均观察到 ABCG2 mRNA 表达的下调（与对照组相比，p < 0.05）（图 3C）。在所有肿瘤组织切片中，对照细胞的细胞质和细胞膜的染色比在用 ART 处理的样品中观察到的更强烈。在每组中观察到不同的染色，但与对照异种移植物相比，在 120 mg·kg -1 ART 治疗组中观察到很少或没有观察到 p-EGFR 或 ABCG2 染色（图 4）。

图 4. ABCG2、Akt、p-Akt 和 p-EGFR 蛋白在未处理和 ART 处理（60 mg·kg -1和 120 mg·kg -1）异种移植物中的表达。显示了 ABCG2、Akt、p-Akt 和 p-EGFR (×40) 的免疫组织化学染色照片。在膜和细胞质中可以观察到明显的黄色染色。呈现的图像代表三个独立实验。数据是一式三份进行的三个独立实验的平均值±SE。*与对照组相比，p < 0.05。条形，100 μm。

2.7. 讨论
EGFR 是受体酪氨酸激酶 (TK) erbB/HER 家族的成员。在与其配体结合后，EGFR 与其他 erbB 受体同源二聚化或异二聚化，导致受体在细胞质尾部内的特定 TK 残基处发生自磷酸化。激活的受体募集信号复合物并激活 Ras/丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、细胞外信号调节激酶 (ERK)、磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt、信号转导和转录激活因子 (STAT)，以及磷脂酶 C γ 途径。这些途径是肿瘤细胞生长、侵袭、转化和存活的有效致癌调节剂。EGFR 还与血管生成、通过基质金属蛋白酶的侵袭和肿瘤细胞运动有关，所有这些都有助于转移 [ 24, 25 , 26 ]。EGFR 经常在人类肿瘤中过度表达，例如 NSCLC、头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 和胶质母细胞瘤 [ 27 ]。
本研究表明，ART以浓度和时间依赖性方式抑制A549细胞的生长和增殖，并以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡。ART治疗后，A549细胞和异种移植肿瘤模型中EGFR的表达下调。这些发现表明 EGFR 可能参与 ART 介导的细胞毒性，并可能成为 ART 治疗肺癌的一个有希望的靶点。
癌症化疗的功效受到细胞耐药机制的限制，耐药机制导致化疗药物流出增加，从而降低细胞内药物水平。细胞获得对多种化合物的耐药性的能力，称为多药耐药性 (MDR)，通常由 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白的过表达介导，该转运蛋白逆浓度梯度将底物移出细胞 [ 28]。ATP 结合盒转运蛋白家族的成员与多种恶性肿瘤（如白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌和结肠直肠癌）对化学疗法和电离辐射的抵抗力有关。评估具有 SP 表型的细胞的研究表明，干细胞过表达 ABCG2 而不是 ABCB1，这是大多数临床研究中靶向的转运蛋白 [ 29 ]，因此，开发 ABCG2 抑制剂非常重要。复方 fumitremorgin C (FTC) 是一种天然产物，可特异性抑制 ABCG2 [ 30 ]。然而，这种化合物对细胞和小鼠都有毒，因此不适合临床研究。
迄今为止，已经报道了几种具有不同结构的 BRCP/ABCG2 抑制剂，但其确切的抑制机制尚未得到充分研究 [ 30 ]。据报道，细胞因子和生长因子也会改变 ABCG2 基因的表达。当从 MCF-7 细胞中分离出 ABCG2 阳性侧群细胞并用转化生长因子-β 处理时，ABCG2 基因表达下降 [ 31 ]。用肿瘤坏死因子-α 或白细胞介素-1 β 治疗原代滋养细胞降低了 ABCG2 的 mRNA 和蛋白质水平，而用胰岛素样生长因子 II 治疗增加了表达 [ 32]。需要进一步的研究来准确描述控制 ABCG2 表达的机制。几项研究报道，蛋白激酶 Akt 参与调节 ABCG2 蛋白的表面表达。茂木等人。是第一个报告 Akt1 缺陷型小鼠的侧群细胞数量减少 [ 33 ]，这是一种独特的 Abcg2 阳性造血干细胞群，当骨髓细胞与 DNA 染料 Hoechst 33342 一起孵育时变得可见。来自正常小鼠的群体细胞与磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 一起孵育，Abcg2 从质膜转移到细胞质，尽管总蛋白表达似乎没有受到影响 [ 33]。当用 Akt1 转染骨髓细胞时，在侧群中观察到细胞数量增加 [ 34 ]。高田等人。随后报道，在 ABCG2 转染的 LLC-PK1 极化肾细胞中，磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 和渥曼青霉素均导致 ABCG2 表达从顶膜转移到细胞内空间，并且这种转移与 Akt 的磷酸化状态相关。14 ]。在本研究中，我们发现用 ART 治疗 A549 细胞和异种移植肿瘤模型可抑制 Akt 的磷酸化并显着下调 ABCG2 的 mRNA 和蛋白水平。这些结果暗示ART可能调节肺癌细胞中ABCG2的表达体外和体内。ART 可能通过 PI3K/Akt 下调 EGFR 下游信号。据报道，ART 不会抑制 ABCG2 将药物泵出细胞的功能 [ 35 ]，然而，本研究表明 ART 下调 ABCG2 的 mRNA 和蛋白质水平。因此，我们假设低浓度的 ART 不会抑制 ABCG2 功能，但高水平可能。这一理论需要在未来的研究中进行检验。

3. 实验
   3.1。试剂
   ART 购自 Sigma Aldrich (CA)。针对 EGFR 和 p-EGFR（磷酸化 S1070）的兔多克隆抗体和针对 BCRP/ABCG2 的大鼠单克隆抗体 (Bxp-53) 购自 Abcam Hong Kong Ltd.（中国香港）。Akt (Ab-473) 和 p-Akt (Phospho-Ser473) 的兔多克隆抗体购自 Signalway Antibody Co., Ltd (Pearland, TX, USA)，山羊抗兔 IgG（过氧化物酶偶联物）和山羊抗大鼠 IgG（过氧化物酶偶联物）购自 Boster（中国武汉）。甲基噻唑基四唑 (MTT) 购自 Sigma Aldrich。
   3.2. 细胞和治疗
   A549 人肺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD，USA）。A549 细胞在含有 5% CO 2的潮湿气氛中维持在补充有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素（所有试剂均购自 HyClone，Thermo，China）的 RPMI-1640 培养基中在 37 °C。A549 细胞以 5 × 10 5接种在瓶中每瓶细胞培养 24 h。然后用 12.5-100 μM 的 ART 处理细胞 48 小时。将 ART 作为储备溶液 (100 mM) 溶解在二甲亚砜 (DMSO, Sigma) 中并直接添加到培养基中。处理后，使用 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 从底物中收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次。处理过的细胞用于 RNA 和蛋白质提取。
   3.3. 增殖试验
   将指数生长的细胞以 5 × 10 3 /孔的密度添加到 96 孔板中。然后将 ART (6.25–100 μM) 添加到孔中，每个孔的总体积为 200 μL。使用基于标准甲基噻唑基四唑 (MTT) 的测定法在 24、48、72 和 96 小时测量细胞数。简而言之，将 MTT 以 1 mg/mL 的工作浓度添加到每个孔中，并将板放回培养箱中 4 小时。此后，通过抽吸去除培养基，向每个孔中加入 150 μL DMSO，将板轻轻搅拌 10 分钟，然后测量 490 nm 处的光密度。处理的效果被确定为与未处理细胞相比的活力百分比。
   3.4. 细胞凋亡
   将A549 细胞 (2 × 10 5 ) 培养 48 小时并用 ART (25、50 和 100 μM) 一式三份处理。用膜联蛋白 V/异硫氰酸荧光素 (FITC) 和碘化丙啶 (Beyotin Biological Engineering Co. Ltd., China) 对细胞进行双色荧光染色。在黑暗中孵育3×10 4细胞15分钟后，使用EPICS XL流式细胞仪（Beckman Coulter）通过流式细胞术对凋亡细胞进行计数。
   3.5. 动物实验
   5周龄雄性BALB/c无胸腺裸鼠获自第三军医大学新桥医院动物研究中心。所有动物实验均符合世界卫生组织关于人道使用和照顾动物的指南。通过将1×10 6 A549细胞皮下注射到小鼠的右腋窝中来建立肿瘤。每周两次检查小鼠的肿瘤形成情况，并使用滑动卡尺测量肿瘤大小。根据经验方程V=（长×宽2）/2计算肿瘤体积（V）。当肿瘤达到约 100 mm 3的平均体积时，将小鼠随机分为三组（n = 5）并进行以下治疗：（) 蒸馏水（对照）；( b ) 60 mg·kg -1 ART 或 ( c ) 120 mg·kg -1 ART。每只动物每天一次通过强饲法接受治疗，持续两周。在切除肿瘤之前密切监测小鼠。每个肿瘤被分成三部分：一个固定在 10% 多聚甲醛中，一个储存在 RNAiso Reagent 中，在 -80 °C 下用于以后的实时 RT-PCR 分析，第三个储存在 -80 °C 下用于进一步分析。
   3.6. 实时 RT-PCR 分析
   实时 RT-PCR 用于使用 RNAiso 试剂和 SYBR PrimeScrip RT-PCR 试剂盒（TaKaRa Biotechnology，大连，中国）确定 A549 细胞和肺癌异种移植物中 EGFR 和 ABCG2的转录水平。目标基因的引物序列见表 1。使用循环时间 (Ct) 值表示组间表达的相对差异如下：首先将感兴趣基因的 Ct 值相对于来自同一样品的 β-肌动蛋白标准化，然后是对照组和治疗组之间的相对差异计算并表示为相对增加或减少，Applied Biosystems 7500 系统上的控制设置为 1.0。

表 1. 实时 RT-PCR 分析的引物序列

3.7. 免疫组化染色
将肿瘤样本固定在 10% 多聚甲醛中并包埋在石蜡中。用于免疫组织化学的切片被切割为 4 μm。对于 EGFR、P-EGFR 和 ABCG2 检测，通过将切片浸入 pH 6.0（DakoCytomation，Carpinteria，CA，USA）中的切片然后在微波炉中加热 20 分钟来进行抗原修复。通过在 3% H 2 O 2中孵育来淬灭内源性过氧化物酶活性15分钟。为了阻断非特异性结合位点，切片用 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 处理 20 分钟。将切片与一抗在 4 °C 下孵育过夜（EGFR 和 P-EGFR 稀释度为 1:100，ABCG2 稀释度为 1:50）。使用针对 EGFR 和 p-EGFR 的过氧化物酶缀合的山羊抗兔 IgG 二抗以及针对 ABCG2 的过氧化物酶缀合的兔抗大鼠 IgG 二抗检测兔多克隆抗体。DAB 用于染色，BSA 用于替代对照中的一抗。工作对照组用 PBS 代替抗体。切片用苏木精复染。
3.8. 蛋白质印迹
对于蛋白质印迹分析，通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Rad) 电泳分离 40 μg 总蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜 (Bio-Rad) 上。洗涤四次后，将膜与 Blocking 试剂盒（Boster，中国）在室温下孵育 1 小时，然后在 4 °C 下与以下一抗孵育过夜：抗 EGFR、抗磷酸化 EGFR（p-S1070 , Abcam, Hong Kong)、抗 Akt 和抗磷酸化 Akt (p-Ser473)（1:1,000 稀释度，Signalway Antibody）。蛋白质水平针对来自同一样品的 β-肌动蛋白（1:3,000 稀释度，Boster，China）进行标准化。洗涤 3 次后，将膜与物种特异性辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育 1 小时。
3.9. 统计分析
所有测定重复 3 次，结果以平均值±标准差表示。使用学生t检验分析定量实验。使用 SPSS 17.0 统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA），p < 0.05 被认为具有统计学意义。
4。结论
总之，我们的研究结果表明，ART 通过下调肺癌细胞中的 EGFR 及其下游因子 Akt 发挥抗肿瘤作用。此外，ART在体外和体内下调 ABCG2 的表达。由于其目标的多样性，ART 可以与其他互惠作用的药物联合使用 [ 36 , 37 ]。此外，ART的疗效可以通过与其他药物联合来逆转ABCG2介导的多药耐药性来增强。综上所述，这项研究的结果表明，ART 具有显着的抗肿瘤活性，代表了非小细胞肺癌的潜在治疗方法。
致谢
本研究得到国家自然科学基金81071786和81172070资助，重庆市科技攻关，CSTC，2011AB5032。军事临床高技术资助2010gxjs070和国家高技术研究发展计划2008AA02Z104资助。我们感谢西南华盛顿医学中心病理学和实验室范舟阅读手稿。

参考文献和注释

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